零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理
零背景平末端快速連接試劑盒是一種優良的zi殺基因陽性選擇克隆系統，可以高效克隆平末端 PCR 產物和任何具有平末端的DNA 片段。該試劑盒對磷酸化或非磷酸化的 DNA 片段都有效。 陽性選擇載體和插入片段連接僅需 5 分鐘即可獲得超過 90%的陽性重組克隆。零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理
Zero-Blunt Simple Quick Ligation Kit
pZERO-Blunt Simple零背景平末端快速連接試劑盒
(不含MCS)
零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理
目錄號：42113
試劑盒組成、儲存、穩定性：
試劑盒組成 | 20次(42113-20) | 40次(42113-40) |
pZERO-Blunt Simple Vector(40ng/ml) | 20 ml | 40 ml |
1K bp Control（40ng/ml） | 5 ml | 5 ml |
2 ′ Quick Ligation Buffer | 100 ml | 200 ml |
T4 DNA ligase, 5U/ml | 20 ml | 40 ml |
pZERO-Blunt Simple Forward Sequencing Primer (10µM) | 100 ml | 200 ml |
pZERO/Blunt Simple Reverse Sequencing Primer (10µM) | 100 ml | 200 ml |
－20℃儲存，6個月內不影響使用效果。
產品介紹：
零背景平末端快速連接試劑盒是一種優良的zi殺基因陽性選擇克隆系統，可以高效克隆平末端 PCR 產物和任何具有平末端的DNA 片段。該試劑盒對磷酸化或非磷酸化的 DNA 片段都有效。 陽性選擇載體和插入片段連接僅需 5 分鐘即可獲得超過 90%的陽性重組克隆。由具有校正活性的聚合酶（如：Pfu polymerase）擴增的平末端PCR產物可直接連入克隆載體。連接產物可直接轉化常用的大腸桿菌菌株。
試劑盒提供一個新穎的zi殺基因陽性選擇克隆載體pZERO-Blunt Simple。該載體含有致死的zi殺基因，當載體與片段連接成功，zi殺基因無法正確表達，包含重組子的細胞可以正常生長；當載體與片段連接不成功，載體自連后zi殺基因正確表達，包含自連空載體的細胞無法存活，即“零ZERO"背景。這種陽性篩選策略無需藍白斑篩選，極大地加速了克隆篩選進程。
pZERO-Blunt Simple消除了插入位點附近的多克隆酶切位點，需要在PCR擴增引物上導入合適的酶切位點。此時如果使用PCR擴增引物導入的酶切位點進行DNA酶切時，酶切反應將不會受到T載體上其它多克隆酶切位點上的限制酶影響，可以大大提高酶切效率，增加亞克隆成功率。
操作步驟：
1. 連接反應的準備：
平末端PCR產物或者酶切后平末端片段可以通過瓊脂糖凝膠電泳分離回收（使用長波紫外光下切膠或者可見光透射切膠避免DNA損傷造成連接失敗）。與載體的摩爾比是 3:1。本公司生產的DNA產物快速純化回收試劑盒對70bp以上的DNA片段能很好地進行回收。
2. 快速連接反應：
1) 在一個標準的10 ml連接反應體系中，加入1 ml 40ng pZERO-Blunt Simple載體、X ml PCR產物(在通常狀況下，沒有必要對PCR產物進行精確定量，一般PCR產物與載體的摩爾比優化至1:1~10:1就可以得到良好結果，推薦3:1，見附錄)、5ml 2 ′ Quick ligation Buffer和0.9ml 的T4 DNA Ligase，其余用滅菌水補足。
反應按以下體系進行：
5ml | 2 ′ Quick Ligation Buffer |
1ml | pZERO-Blunt Simple載體 |
Xml | 純化后的PCR產物/或者1ml 1000bp control |
Yml | 滅菌水 |
0.9ml (5 Weiss Units/ml) | T4 DNA Ligase |
Final Volume | 10ml |
一般最后加入T4 DNA Ligase。
2) 22℃連接5-10分鐘（一般可在PCR儀器完成）。
通常推薦22℃連接5-10分鐘 ，>3kb長片段連接可以延長至30分鐘。不推薦超過30分鐘，超過可能降低轉化子數量。
3) 冰上冷卻，然后轉化或貯存于-20℃。
3. 轉化：
1) 100ml感受態細胞，置于冰上，wan全解凍后輕撣幾次將細胞均勻懸浮。
2) 加入4－5ml連接液(最多可全部加入，只要連接液體積不超過感受態細胞體積的1/10)，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。
3) 42℃水浴熱激90秒。冰上放置2~3分鐘。
4) 加500ml LB或者SOC培養基(不含抗生素)，37℃ 150 rpm振蕩培養60分鐘。
5) 將200ml細菌涂布在氨芐青霉su(100mg/ml)平板上。
涂布細菌的用量依連接的效率及感受態細胞的感受率而進行適當的調整，如果 預計的克隆較少，可通過離心（4,000rpm，2 分鐘）后吸除部分培養液，留下適量的培養基懸浮菌體后取全部或者適量涂布于一個平板中（涂布剩余的菌液可以擱在4度保存，第2天如果轉化菌落數量少，可將剩余菌液全部涂一個新培養板)。
6) 平板在37℃下正向放置1小時以吸收過多的液體，然后倒置培養過夜。
4. 篩選：
5. 常規檢測：將得到的菌落接種 1-5 ml LB（含有終濃度為 100mg /ml 的氨芐青霉su）培養基，37℃搖床振蕩培養過夜，保存菌種后提取質粒，應用 PCR 或酶切方法鑒定插入片段是否正確。
6. 快速檢測：挑取菌落直接進行PCR檢測（可參見分子克隆第3版本或者參考本公司CV05-通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒說明書）。
7. 測序鑒定：使用試劑盒自帶引物或者T7啟動子引物測序確定是否含有目的克隆。
本試劑盒自帶測序引物（也用于菌落PCR鑒定引物）：
Forward sequencing primer, 23-mer | 5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGTC- 3’ |
Reverse sequencing primer, 24-mer | 5’-AAGAACATCGCTTTTCGATGGCAG- 3’ |
附錄：
e 如何計算連接反應中需要的PCR產物的量?
一般PCR產物與載體的摩爾比優化至1:1~10:1（推薦3:1）就可以得到良好結果，可采用以下公式：
[加入載體的量（ng）×插入片段大小（kb）÷載體大小（kb）]×插入片段和載體的摩爾比=插入片段的量（ng） 例如：插入片段和載體連接的摩爾比例為3:1，如連接反應中加入載體40ng，插入片段大小為500bp，這時應加入插入片段的量為[40ng載體×0.5kb插入片段÷2.974kb載體]×3/1=20.2ng。
零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理
