IIImiRNA First Stand Synthesis Kit反轉錄
Script III miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）采用第三代高效逆轉錄酶，具有更強的延伸能力和穩定性，并配備了具有DNA分解活性的特殊dsDNase，只需一步操作， 即可同時完成基因組清除與莖環法miRNA逆轉錄反應，操作方便快捷。IIImiRNA First Stand Synthesis Kit反轉錄
Script III miRNA1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）莖環法 miRNA 第一連反轉錄試劑盒 打印
IIImiRNA First Stand Synthesis Kit反轉錄
目錄號:71505
產品內容
Components | 71505-50 50 rxns (20 μl/rxn) | 71505-100 100 rxns (20 μl/rxn) |
5x miRT Reaction Mix | 200 μl | 400 μl |
dsDNase | 50 μl | 100 μl |
RNase free H2O | 1.5 ml | 1.5 ml |
保存條件
-20℃保存，有效期 12 個月。
產品簡介
Script III miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）采用第三代高效逆轉錄酶，具有更強的延伸能力和穩定性，并配備了具有DNA分解活性的特殊dsDNase，只需一步操作， 即可同時完成基因組清除與莖環法miRNA逆轉錄反應，操作方便快捷。逆轉錄產物可以用于后續的染料法或探針法熒光定量檢測。此方法特異性高只對成熟的miRNA進行反轉，不受其前體干擾，序列高度同源的miRNA也可精確區分。本試劑盒具有可從20 pg ~ 2 μg的total RNA中高效制備miRNA對應的第一鏈cDNA。
原理：本試劑盒采用莖環結構的逆轉錄引物與 miRNA 分子的3’端 結合，并在逆轉錄酶的作用下進行反應，獲得人為加長的 miRNA 第一鏈 cDNA。
引物的制備：
需要自己設計、合成用于反轉錄的頸環引物！
microRNA莖環引物及Realtime-PCR引物設計方法如下：
1. stem-loop RT引物設計：
基于通用的莖環結構，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6個堿基即可。通用莖環結構序列為：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC。
例如設計miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用莖環序列后加上miRNA3’末端的6個堿基的反向互補序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGACATACAT。
2. realtime 上游引物設計：
miRNA序列除去3’端6個堿基 的剩余部分作為上游引物，如miR-1的上游引物為(注意 把U改為T)：TGGAATGTAAAGAAGT.檢查引物的Tm 值（一般參考DNAMAN），如果Tm值較低，則在5’端加GC使Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可設計 為：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。
下游引物是通用的，序列為GTGCAGGGTCCGAGGT。
引物設計好后，需要通過預試驗檢測引物的特異性。一般需要做溶解曲線來檢測引物的特異性；同時最好將PCR產物進行電泳檢測產物是否單一（產物長度很短，需要3%以上的瓊脂糖膠）
操作步驟： (以20 μl反應體系為例)
1．莖環法反轉錄體系的配制
使用 RNase-Free PCR 管在冰上配制：(使用前，請將各組分輕彈混勻，點甩離心收集至管底，置冰上備用。)
Components | Volume |
Total RNA / miRNA | 20 ng - 2 μg / 5 ng -200 ng |
Stem-loop Primer(0.1 μg/μl) | 1 μl |
5x miRT Reaction Mix | 3.6 ~ 4 μl (注意事項 1) |
dsDNase | 1 μl |
RNase free H2O | To 20 μl |
2．輕柔吸打混勻，點甩離心，置 PCR 儀進行逆轉錄反應。
25℃孵育 5 min 后， 42℃孵育 20 min，85°C 加熱 5 sec，失活 RTase 和 dsDNase，終止反應。
3．合成的cDNA反應液可放置于-20℃保存，也可以直接進行下游PCR或者熒光定量qPCR檢測。
注意事項：
1. 在反應中使用的total RNA 必須含有小分子RNA 。
2. 此過程也可以使用小分子RNA， miRNA無法直接用分光光度計定量，建議加入量為2μl ~5μl。可根據目的miRNA豐度決定加入量，但是對于低豐度miRNA 樣品而言(如血清血漿提取物)，可直接加入最大體積8 μl。
3. 5 × miRT Reaction Mix非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導致損失，用前請點甩離心后使用，并且避免吸頭外壁沾附損失。可以每次按照3.6-3.8μl使用，也不影響使用效果。
按照miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒(貨號P501)進行qPCR。
注：按照上述操作步驟得到的cDNA模板用于下游PCR或者熒光定量PCR檢測時，可以根據實際情況選擇使用量，對于特殊的檢測體系中，高含量的cDNA模板易導致非特異性擴增，可根據所檢測miRNA的豐度適當的稀釋cDNA（5-10倍或者100倍）后使用。如果發現有非特異擴增條帶，或者融鏈曲線顯示有非特異擴增，往往提示cDNA模板過量，可以嘗試將上述cDNA模板稀釋幾十到幾百倍甚至上千倍再使用。
IIImiRNA First Stand Synthesis Kit反轉錄
